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Enucleación química de oocitos bovinos para transferencia nuclear

Por: Yauri Felipe, Minerva.
Colaborador(es): Salamone, Daniel Felipe [dir.] | Fernández Martín, Rafael [co-dir.].
Publicación: 2020Descripción: 78 p. il., grafs., fot.Tipo de material: Tesis de posgrado de lectura en biblioteca. Recurso electrónico.Tema(s): PRODUCCION ANIMAL | CLONACION | ENUCLEACION | QUIMICA | GANADO BOVINO | TRANSFERENCIA DE GENES | METODO HAPLOIDET20201201 Recursos en línea: Haga clic para acceso en línea Nota de tesis: Tesis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Escuela para Graduados. Magister de la Universidad de Buenos Aires área Producción Animal. Maestría en Producción Animal. 2020. Resumen: La enucleación del oocito es una etapa crucial en la técnica de clonación por transferencia nuclear de células somáticas. En general se realiza usando un micromanipulador y microscopia de fluorescencia. El objetivo de esta Tesis fue desarrollar un método eficiente en la enucleación química utilizando la ionomicina (Io), un ionóforo; la roscovitina (Rosco), un inhibidor especifico de la quinasa dependiente de clínica 1 (cdc2 por sus siglas en inglés; cell division control protein 2 homologo); y la demecolcina (DMC), una droga que despolimeriza los microtúbulos. Los oocitos fueron tratados con 0,4 μg/ml de DMC después de la primera hora pia por 0, 30, 60 y 300 minutos (min), denominados grupo: control, 1DMC30; 1DMC60; 1DMC300 respectivamente, o a las 3 h pia por 180 min (3DMC180). En el experimento 1, se evaluó la enucleación a las 2; 4; y 6 horas (h) pia en oocitos con zona pelúcida (ZP). Se determinó que los porcentajes de enucleación fueron mayores en los grupos 1DMC30 y 1DMC60 que en los grupos 3DMC180 y 1DMC300. Por lo tanto, para los siguientes experimentos se eligieron los grupos 1DMC30 y 1DMC60. En el experimento 2 se evaluó la enucleación a las 17 h pia en oocitos con ZP. Los porcentajes de enucleación fueron inferiores a los del experimento 1. Por esto, en el experimento 3 se comparó la evaluación de enucleación en oocitos con y sin ZP a las 6 h pia. Observamos que los porcentajes de enucleación en oocitos con y sin ZP no presentaron diferencias significativas en los grupos 1DMC30 y 1DMC60, pero si respecto a los grupos controles. Finalmente, en los grupos 1DMC60 y 1DMC30 en oocitos sin ZP, se evaluó la lo invertido con: a) luz blanca o b) luz UV y tinción con Hoechst 33342. En 1DMC30 no hubo diferencias en las tasas de enucleación, pero en 1DMC60 los porcentajes fueron menores con luz blanca. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con DMC, Io y Rosco es un protocolo simple y eficiente para la enucleación química del oocito.
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Tesis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Escuela para Graduados. Magister de la Universidad de Buenos Aires área Producción Animal. Maestría en Producción Animal. 2020.

La enucleación del oocito es una etapa crucial en la técnica de clonación por transferencia nuclear de células somáticas. En general se realiza usando un micromanipulador y microscopia de fluorescencia. El objetivo de esta Tesis fue desarrollar un método eficiente en la enucleación química utilizando la ionomicina (Io), un ionóforo; la roscovitina (Rosco), un inhibidor especifico de la quinasa dependiente de clínica 1 (cdc2 por sus siglas en inglés; cell division control protein 2 homologo); y la demecolcina (DMC), una droga que despolimeriza los microtúbulos. Los oocitos fueron tratados con 0,4 μg/ml de DMC después de la primera hora pia por 0, 30, 60 y 300 minutos (min), denominados grupo: control, 1DMC30; 1DMC60; 1DMC300 respectivamente, o a las 3 h pia por 180 min
(3DMC180). En el experimento 1, se evaluó la enucleación a las 2; 4; y 6 horas (h) pia en oocitos con zona pelúcida (ZP). Se determinó que los porcentajes de enucleación fueron mayores en los grupos 1DMC30 y 1DMC60 que en los grupos 3DMC180 y 1DMC300. Por lo tanto, para los siguientes experimentos se eligieron los grupos 1DMC30 y 1DMC60. En el experimento 2 se evaluó la enucleación a las 17 h pia en oocitos con ZP. Los porcentajes de enucleación fueron inferiores a los del experimento 1. Por esto, en el experimento 3 se comparó la evaluación de enucleación en oocitos con y sin ZP a las 6 h pia. Observamos que los porcentajes de enucleación en oocitos con y sin ZP no presentaron diferencias significativas en los grupos 1DMC30 y 1DMC60, pero si respecto a los grupos controles.
Finalmente, en los grupos 1DMC60 y 1DMC30 en oocitos sin ZP, se evaluó la lo invertido con: a) luz blanca o b) luz UV y tinción con Hoechst 33342. En 1DMC30 no hubo diferencias en las tasas de enucleación, pero en 1DMC60 los porcentajes fueron menores con luz blanca. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con DMC, Io y Rosco es un protocolo simple y eficiente para la enucleación química del oocito.

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